题目：The transcription factor CmERFI-2 represses CmMYB44 expression to increase sucrose levels in oriental melon fruit
刊名：Plant Physiology
作者：Ge Gao/ Hongyan Qi et al/
单位：Shenyang Agricultural University/ Shenyang
日期：20 March 2023
01
摘要
果实成熟过程中可溶性糖的积累决定了肉质果实的品质。然而，这一过程的分子机制尚不清楚。在这里，我们发现了一种转录抑制因子CmMYB44调节东方甜瓜果实中蔗糖积累和乙烯合成。过表达CmMYB44抑制蔗糖积累和乙烯产生。
此外，CmMYB44分别抑制蔗糖和乙烯积累的两个关键基因CmSPS1（蔗糖***酸合成酶1）和CmACO1（ACC氧化酶1）的转录激活。在果实成熟后期，CmMYB44对CmSPS1和CmACO1的抑制作用可以通过在“HS”果实（高蔗糖积累果实）中过表达CmERFI-2（乙烯反应因子I-2）和外源乙烯来释放。
CmERFI-2通过直接结合CmMYB44启动子区作为阻遏物在CmMYB44-上游发挥作用，间接***CmSPS1和CmACO1的表达水平。总之，我们提供了一种由CmMYB44介导的分子调控途径，该途径决定了东方甜瓜果实中蔗糖和乙烯的积累程度，并揭示了乙烯感应引发的转录反应，从而使果实成熟。
02
技术路线
high sucrose cultivar HS’ and low sucrose cultivar LW’ melon seedling
Ethylene and 1-MCP treatments
Measurements of Soluble Solids and soluble sugar content
Measurement of ethylene production
RNA extraction/ cDNA synthesis and genes expression analysis
Subcellular localization
Transcriptional activation assays\Yeast one-hybrid assay\EMSA\GUS analysis
Agrobacterium-mediated infiltration\Stable transformation of oriental melon
03
主要结果
3/1 HS’果实的蔗糖水平明显高于 LW’果实
为了研究 HS’果实甜度的基础，我们首先比较了 HS’和 LW’果实的可溶性固形物含量。基于两年（2018年和2020年）的测量，我们发现“HS”果实的可溶性固形物含量高于“LW”果实（图1B和补充图S1A）。为了确定“HS”果实中哪些糖含量较高，使用高效液相色谱法（HPLC）测量了不同果实发育阶段的葡萄糖、果糖和蔗糖含量。从30到35DAA（开花后几天），我们观察到“HS”果实中的蔗糖水平显著高于“LW”果实（图1E）。同时，葡萄糖和果糖没有观察到显著差异（图1C，D）。结果与2018年的测量数据一致（补充图S1B-D）。这些发现表明，较高的“HS”糖含量和甜味是由于蔗糖积累较多。
图1。 HS’和 LW’果实发育过程中的表型、可溶性固形物和糖含量。A/ HS’和 LW’的果实。B-E。果实发育过程中 HS’和 LW’的可溶性固形物和糖含量。糖度计用于测量可溶性固体（B）的含量。采用高效液相色谱法（HPLC）测定了2018年花后指示日采集的果实中果糖（C）、葡萄糖（D）、蔗糖（E）的含量。3/2蔗糖***酸合成酶CmSPS1在“HS”果实中高度表达
为了鉴定可能有助于“HS”果实中较高蔗糖积累的基因，我们首先测量了蔗糖代谢酶（AI、NI、SS和SPS）的活性，数据显示，从30到35DAA，“HS”水果中SPS的活性显著高于“LW”水果（图2A），而SS中没有发现显著差异，AI和NI活动（补充图S2A-C）。
我们通过RT-qPCR比较了已知参与蔗糖卸载（AGAs）、转运（SWEETs和SUTs）和代谢（SPSs）的家族基因成员的表达模式。并分析了上述基因在不同果实发育阶段的表达与蔗糖含量的相关性。结果显示，在开花后35天，“HS”果实中的CmSPS1表达量比“LW”果实高约8倍（图2B）。
CmSPS1与蔗糖含量呈正相关，相关系数为0/9635（补充图S3），而CmSPS2和CmSPS4的表达水平与蔗糖含量不一致（图1E和补充图2D-E）。
我们从两个品种中***了该基因，并且CmSPS1的编码区（3162bp）完全相同（补充图S4）。总的来说，CmSPS1在 HS’果实中的高表达是导致蔗糖积累的关键因素
图2/蔗糖***酸合成酶（SPS）活性、CmSPS1。A/ HS’和 LW’在果实不同发育阶段的蔗糖***酸合成酶（SPS）活性。B/ HS’和 LW’果实不同发育阶段的CmSPS1表达分析。C-D。 HS’果实中CmSPS1过表达/反义的表型和萤光素酶活性。在注射后0/5、1/5、2/5、4/5、6/5和8/5天观察到表型和萤光素酶。CmSPS1 OE，CmSPS1过表达果实；CmSPS1-AN、CmSPS1沉默果实；空载体、过表达空pCAMBIA3301 LUC载体和表达空pRI101载体的对照果实。E/ HS’果实中CmSPS1过表达的LUC信号强度。G和J。可溶性固体含量通过糖度计测量。CmSPS1 OE，CmSPS1过表达果实；CmSPS1-AN、CmSPS1沉默果实；空载体、过表达空pCAMBIA3301 LUC载体和表达空pRI101载体的对照果实。用高效液相色谱法测定了蔗糖的含量。CmSPS1 OE，CmSPS1过表达果实；CmSPS1-AN、CmSPS1沉默果实；空载体、过表达空pCAMBIA3301 LUC载体和表达空pRI101载体的对照果实。3/3CmSPS1在冬瓜果实蔗糖积累中的作用
为了鉴定CmSPS1在东方甜瓜果实中的功能，我们在CaMV35S启动子的控制下，使用根癌农杆菌介导的渗透在 HS’和 LW’果实中过表达CmSPS1。使用空的pCAMBIA3301 LUC载体作为对照。在每个采样时间点检测LUC荧光信号。注射后0/5至8/5天，LUC荧光信号强度先增加后降低（图2C-E，补充图S5A-C）。在CmSPS1过表达的果实（CmSPS1-OE）中检测到更高的CmSPS1表达（图2F），可溶性固形物和蔗糖含量显著高于对照果实（图2G-H，补充图图S5E-F）。
鉴于 LW’是一个低蔗糖品种，我们使用根癌杆菌介导的渗透在 HS’果实中反义表达CmSPS1，以进一步验证CmSPS1的功能。在CmSPS1沉默的 HS’果实中检测到CmSPS1的低表达（图2I），可溶性固形物和蔗糖含量显著低于对照果实（图2J-K），表明CmSPS1对冬瓜果实中的蔗糖积累至关重要。
3/4CmACO1对东方甜瓜果实乙烯合成和蔗糖积累至关重要
对 HS’和 LW’冬瓜果实发育成熟过程中内源乙烯的浓度进行了评价。乙烯产量的峰值出现在 HS’果实的33DAA，而 LW’果实的乙烯含量在整个发育期内变化不大（图3A）。
使用RT-qPCR检测11个ACSs和9个ACOs基因家族成员在乙烯合成途径中的表达（图3B-G）结果表明，CmACS1、CmACS11、CmACS12、CmACO1、CmACO5和CmACO6是乙烯合成的关键基因（图3B-G）
之前的研究表明，在所有与乙烯合成相关的基因中，只有CmACO1是由外源乙烯诱导的。因此，我们选择CmACO1作为候选基因来验证其在东方甜瓜果实中的功能。利用根癌农杆菌介导的渗透，CmACO1在 HS’和 LW’果实中均过表达。使用空的pCAMBIA3301 LUC载体作为对照。类似地，注射后0/5至8/5天，LUC荧光信号强度先增加后降低（图3H-J，补充图S5A-C）。
在CmACO1过表达的果实（CmACO1-OE）中观察到CmACO1的高表达（图3K，补充图S5G），乙烯产量和蔗糖含量显著高于对照果实（图3L-M，补充图S5 H-I）。考虑到 LW’没有明显的乙烯产生峰值，我们只在 HS’果实中反义表达了CmACO1，以进一步验证CmACO1的功能。在CmACO1沉默的 HS’果实（CmACO1-AN）中检测到较低的CmACO1表达（图3N），乙烯产量和蔗糖含量显著低于对照果实（图3O-P）。这些结果表明，CmACO1对东方甜瓜果实中乙烯的合成和蔗糖的积累至关重要。
图3。乙烯生产、CmACSs和CmACOs的表达水平以及CmACO1的功能分析。A/ HS’和 LW’果实在不同发育阶段乙烯产量的变化。（B）、CMAC11（C）、CMAC12（D）、CMAC1（E）、CMAC5（F）和CMAC6（G）的表达分析。H和I。 HS’果实中CmACO1过表达/反义的表型和萤光素酶活性。J/ HS 果实中CmACO1过表达的LUC信号强度。K和N/CmACO1在 HS’果实中使用根癌农杆菌介导的渗透过表达或沉默。用逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测CmACO1的表达。
L和O。用气相色谱法测定乙烯产量。
3/5转录因子CmMYB44在“LW”果实中高度表达，并对外源乙烯产生反应
为了阐明 HS’和 LW’果实中的CmSPS1表达谱，我们比较了每种果实的CmSPS1-CDS；但没有发现任何差异。此外，在来自“HS”和“LW”的CmSPS1启动子区（距离翻译起始位点1000bp）中没有观察到差异（补充图S7）。
我们分析了CmSPS1启动子（1000bp）的顺式元件，并构建了诱饵载体proCmSPS1-pAbai。结合甜瓜果实酵母单杂交cDNA文库的筛选，MYB转录因子在“LW”果实中的表达比在“HS”果实中更高（图第4B段）。此外，1-MCP显著诱导其表达（图4C）。
我们使用MYB的蛋白质序列作为查询，对拟南芥基因组数据库进行BLAST，并进行多序列比对，命名为CmMYB44。在拟南芥和番茄中，CmMYB44与MYB44的序列比对表明，CmMYB4属于典型的R2R3转录因子。它们都具有转录阻遏物结构域EAR（LxLxL）（图4A）。
我们重点研究了CmMYB44的特性。值得注意的是，35S/：CmMYB44-GFP通过农杆菌介导的瞬时转化渗透到本氏烟草叶片中，以检测CmMYB44的亚细胞定位。CmMYB44-GFP荧光仅在融合蛋白渗透的本氏烟草细胞的细胞核中检测到，而GFP荧光均匀分布在用pCAMBIA1300 GFP空载体渗透的观察到的N/benthamiana细胞中（图4E）。
在酵母系统中评估CmMYB44的转录活性。Y2H-Gold酵母菌株用阳性对照构建体（pCL-1）转化，在SD/-Trp/-His/-Ade选择性培养基上正常生长，并显示出α-半***糖苷酶活性，而携带***性对照构建体pGBKT7和pBD-CmMYB44的酵母菌株不在选择性培养基中生长（图4D）。这些结果表明CmMYB44是一种转录抑制因子
图4。CmMYB44是位于细胞核中的R2R3型MYB转录抑制因子A/使用AtMYB44、CmMYB44和SlMYB44的蛋白质序列进行多序列比对，并标记R2和R3结构域。所有三个候选者都具有***性阻遏物基序LxLxL。深蓝色代表不同物种之间相同的MYB44氨基酸序列，浅蓝色代表不同品种之间不同的MYB44-氨基酸序列。B/转录因子CmMYB44在东方甜瓜 HS’和 LW’果实发育过程中的表达水平。C/在乙烯和1-MCP处理的整个采后贮藏过程中，转录因子CmMYB44在冬瓜 HS’和 LW’果实中的表达水平。D/酵母细胞中CmMYB44的反激活测定。编码GAL4蛋白的pCL-1和空载体pGBKT7（BD）分别用作阳性和***性对照。E/CmMYB44-GFP定位于本氏烟草细胞的细胞核。35S/：CmMYB44-GFP在N/benthamiana叶的表皮细胞中瞬时表达，并通过共聚焦显微镜（×40）观察。3/6CmMYB44抑制 HS’和 LW’果实中的蔗糖积累和乙烯合成
我们将相应的CDS***到pCAMBIA3301载体中，以允许其在CaMV35S启动子的控制下表达，并与LUC标签融合以研究CmMYB44的功能（补充图S8A-C和S9A-C）。该构建体在“HS”和“LW”果实（CmMYB44 OE）中过表达，并且通过RT-qPCR验证了CmMYB44-在CmMYB44-OE果实中的较高表达（补充图S8D和S9D）。
我们检测到CmMYB44 OE果实的可溶性固形物、蔗糖含量和乙烯产量显著低于对照果实（补充图S8G-I和S9G-I）。值得注意的是，CmSPS1和CmACO1在CmMYB44 OE果实中的表达水平也较低（补充图S8E-F和S9E-F）。
我们使用根癌杆菌介导的渗透来沉默CmMYB44在 HS’和 LW’东方甜瓜果实中的表达。在CmMYB44沉默果实（CmMYB44-AN）中检测到CmMYB44-的低表达（补充图S8J和S9J），CmSPS1和CmACO1的表达水平、可溶性固形物、蔗糖含量和乙烯产量显著高于对照果实（补充图S8K-O和S9K-O）。
上述结果表明，CmMYB44可能通过调节CmSPS1和CmACO1的表达在蔗糖积累中发挥重要作用。为了充分探索CmMYB44在东方甜瓜果实中的生物学功能，我们产生了稳定的过表达（OE）转基因系。DNA和RNA水平检测显示，三个转基因系（S1、S2和S3）具有卡那霉素抗性（图S10A、B）。
此外，RT-qPCR分析显示，在T1转基因系中可以检测到kana基因的表达，但在野生植物中不能检测到（图S10C）。CmMYB44在品系1和品系3中的表达水平显著高于野生型果实（图5C）。结果表明，CmMYB44在三个转基因系中成功地过表达。
接下来，选择两条线（第1行和第3行）进行进一步分析。与野生型相比，CmMYB44 OE植物（品系1和品系3）生长正常（图5A-B），但表现出较低的可溶性固形物含量、蔗糖积累和乙烯生产（图5F-H）。同时，CmSPS1和CmACO1在转基因甜瓜果实中的表达水平显著低于野生型果实（图5D-E）。
图5。CmMYB44负调控东方甜瓜果实中蔗糖积累和乙烯合成。A。野生型甜瓜植株和果实的表型。当植株上的甜瓜果实成熟时，对其进行采摘，以测定相关基因的表达、蔗糖含量和乙烯产量。B/转基因东方甜瓜植物和果实的表型（CmMYB44OE，CmMYB44过表达果实）。当植株上的甜瓜果实成熟时，采摘它们来测量相关基因的表达、蔗糖含量和乙烯产量。C-E。采用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测了CmMYB44（C）、CmSPS1（D）和CmACO1（E）在玉米中的表达。品系1和品系3，CmMYB44过表达果实；野生型野生型果实。F/可溶性固体含量用糖度计测定。品系1和品系3，CmMYB44过表达果实；野生型野生型果实。G/蔗糖含量采用高效液相色谱法测定。品系1和品系3，CmMYB44过表达果实；野生型野生型果实。H/用气相色谱法测定乙烯产量。3/7CmMYB44与CmSPS1和CmACO1的启动子结合并下调其转录
为了验证CmMYB44是否能与CmSPS1和CmACO1的启动子相互作用，进行了Y1H测定。PlantCARE预测了启动子上的多个顺式调控元件。将启动子片段与猎物载体pAbai融合，并将pGADT7-CmMYB44引入Y1H-Gold酵母菌株中。结果表明，CmMYB44可以分别直接与CmSPS1和CmACO1的启动子结合（图6A）。
我们用含有MYB基序的CmSPS1和CmACO1启动子的生物素标记片段（CCGTTG）作为标记探针进行了电泳迁移率偏移测定（EMSA），以研究CmSPS1或CmACO1是否是CmMYB44的直接靶标。将His标记的CmMYB44（CmMYB44-His）纯化并用于DNA结合测定。如图6F所示，CmMYB44与CmSPS1和CmACO1启动子结合。当添加未标记的探针作为竞争对手时，CmMYB44与CmSPS1和CmACO1启动子的结合减少，证实CmMYB44-在体外与CmSPS-1和CmACO1启动子结合。
我们使用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）激活测定法，在与Pro35S/CmMYB44和ProCmSPS1/GUS以及ProCmACO1/GUS共渗透后，研究了CmMYB44-对本氏猪笼草叶片中的CmSPS1和CmACO1启动子的调节。Pro35S/GUS用作对照（图6D）。当Pro35S/CmMYB44与ProCmSPS1/GUS或ProCmACO1/GUS共渗透时，与对照相比，CmSPS1和CmACO1启动子的活性显著降低（图6E），表明CmMYB44是CmSPS1的转录抑制因子。
为了进一步证实这一结果，在本氏草叶片中进行了萤光素酶报告基因测定，其中将CmSPS1 pro和CmACO1 pro融合到pRI-mini35S-LUC载体上，并与35S/：CmMYB44在本氏羊笼草***表达（图6B）。令人惊讶的是，在效应子和报告子构建体都存在的情况下，荧光信号低于对照（图6C）。总之，这些结果表明CmMYB44与CmSPS1和CmACO1启动子结合并抑制其转录。
图6。CmMYB44直接与CmSPS1和CmACO1的启动子结合，并作为转录抑制因子。A/CmMYB44与CmSPS1和CmACO1的启动子结合的Y1H分析。转化酵母在两种培养基上的生长状况。酵母在含有抗生素Aureobasidin A的***培养基上的正常生长表明CmMYB44可以与CmSPS1和CmACO1的启动子结合。B和C/萤光素酶报告基因测定显示CmMYB44在体内与CmSPS1和CmACO1启动子结合。D和E/N/benthamiana叶中CmMYB44与CmSPS1和CmACO1启动子结合的GUS活性测定分析。相对GUS活性的降低表明转录调控受到抑制。F/CmMYB44与CmSPS1和CmACO1启动子结合的电泳迁移率偏移测定（EMSA）分析。探针是生物素标记的CmSPS1和CmACO1启动子，而冷探针是未标记的竞争性探针（其浓度是热探针的50/100倍）。3/8CmERFⅠ-2直接与CmMYB44启动子结合并抑制其表达
我们的数据表明，CmMYB44不仅能对乙烯产生反应，而且能与CmACO1的启动子结合，调节乙烯合成。因此，对CmMYB44启动子进行了分析，以阐明CmMYB44和乙烯参与蔗糖积累调节的机制。我们发现CmMYB44的启动子含有一个GCC盒（乙烯反应元件）。
通过筛选冬瓜果酵母cDNA文库，获得了一个ERF转录因子CmERFⅠ-2。RT-qPCR分析显示，CmERFⅠ-2在 HS’果实中比在 LW’果实中更高表达（图7A），外源乙烯显著诱导其表达（图7B）。然后，将35S/：CmERFⅠ-2-GFP渗透到N/benthamiana叶片中，以检测CmERFⅡ-2的亚细胞定位。仅在融合蛋白浸润的本氏N/benthamiana细胞的细胞核中检测到CmERFⅠ-2-GFP荧光，而GFP荧光均匀分布在用pCAMBIA1300 GFP空载体浸润的观察到的本氏N/细胞中（图7D）。
在酵母系统中评估CmERFⅠ-2的转录活性。用阳性对照构建体（pCL-1）转化Y2H金酵母菌株，在SD/-Trp/-His/-Ade选择性培养基上正常生长，并显示出α-半***糖苷酶活性。相反，携带***性对照构建体pGBKT7和pBD-CmERFⅠ-2的酵母菌株没有在选择性培养基上生长（图7C）。
这些结果表明CmERFⅠ-2是一种转录抑制因子。为了验证CmERFⅠ-2是否可以直接与CmMYB44的启动子结合，Y1H显示CmERFⅡ-2与CmMYB4启动子结合（图7E-F），GUS活性和荧光素酶报告基因测定进一步表明CmERFⅢ-2抑制了CmMYB44-启动子的活性（图7G-J）。因此，这些结果表明，CmERFⅠ-2可以抑制CmMYB44，减弱其对CmSPS1和CmACO1的抑制作用，从而促进冬瓜果实中蔗糖的积累和乙烯的合成。
图7。CmERFⅠ-2直接与CmMYB44启动子结合并抑制其表达。A/转录因子CmERFⅠ-2在甜瓜 HS’和 LW’果实发育阶段的表达水平。B/在乙烯（ETH）和1-MCP处理的整个采后贮藏过程中，转录因子CmERFⅠ-2在冬瓜 HS’和 LW’果实中的表达水平。C/酵母细胞中CmERFⅠ-2的反激活测定。编码GAL4蛋白的pCL-1和空载体pGBKT7（BD）分别用作阳性和***性对照。D/CmERFⅠ-2-GFP定位于本氏烟草细胞的细胞核。35S/：CmERFⅠ-2-GFP在N/benthamiana叶片的表皮细胞中瞬时表达，并通过共聚焦显微镜（×40）观察。E/CmERFⅠ-2与CmMYB44启动子结合的Y1H分析。转化酵母在两种培养基上的生长状况。酵母在含有抗生素Aureobasidin A的***培养基上正常生长表明CmERFⅠ-2可以与CmMYB44的启动子结合。G-H/萤光素酶报告基因分析显示CmERFⅠ-2在体内与CmMYB44启动子结合。用***荧光成像仪对感染的本氏烟进行了测量。I-J。叶片中CmERFⅠ-2与CmMYB44启动子结合的GUS活性分析。相对GUS活性的增加表明转录调控受到抑制。3/9CmERFⅠ-2通过调节CmMYB44促进甜瓜果实蔗糖积累
为了验证CmERFI-2对蔗糖积累和CmMYB44的调节作用，我们在 HS’和 LW’果实中瞬时过表达（CmERFⅠ-2-OE）和沉默（CmERFⅠ-2-AN）CmERFⅡ-2（图8A和补充图S11A）。我们通过RT-qPCR证实了瞬时转化瓜果中较高（在CmERFⅠ-2-OE中）和较低（在CmERFⅠ-2-AN中）的相对CmERFⅡ-2转录水平（图8B、F和补充图S11 B、F）。
与这些结果一致，CmERFⅠ-2-OE果实中的蔗糖和乙烯含量显著增加（图8D-E和补充图S11D-E），而CmERFⅡ-2-AN果实中的含量降低（图8H-I和补充图S 11H-I）。值得注意的是，在CmERFⅠ-2转基因果实中，CmMYB44的表达受到与蔗糖积累相反方向的影响（图8C，G和补充图S11C，G）。这些结果表明，CmERFⅠ-2在冬瓜果实中调节CmMYB44转录对蔗糖积累的上游作用。
图8。 HS’果实中CmERFⅠ-2的功能分析。
A/ HS’果实中的表型CmERFⅠ-2-过表达。CmERFⅠ-2-OE、CmERFⅡ-2过表达果实；CmERFⅠ-2-AN、CmERFⅡ-2沉默果实
04
结论
在此基础上，我们构建了CmMYB44和CmERFⅠ-2作为负调控因子对冬瓜果实蔗糖积累和乙烯合成的影响模型。根据该模型，转录抑制因子CmMYB44通过直接抑制CmSPS1和CmACO1的表达水平来抑制蔗糖积累和乙烯合成。进一步的分析表明，CmMYB44在蔗糖积累和乙烯合成中的调节作用受到乙烯和CmERFⅠ-2的抑制，最终导致成熟冬瓜果实中的蔗糖积累（图9）。本研究为研究蔗糖积累的调控机制提供了线索，为进一步研究甜瓜果实成熟和品质形成过程中调控蛋白之间的相互作用奠定了基础。
图9。显示东方甜瓜果实中蔗糖积累的分子机制的模型。乙烯抑制CmMYB44，后者直接与CmSPS1和CmACO1的启动子结合并抑制其表达，而乙烯诱导CmERFⅠ-2，后者抑制CmMYB4的转录。最终导致高蔗糖 HS’瓜果中的蔗糖和乙烯含量更高。两个甜瓜品种（ HS’和 LW’）之间蔗糖含量的差异是由转录因子CmMYB44和CmERFI-2的表达差异引起的下游靶基因（CmSPS1和CmACO1）转录调节强度的差异。05
原文获取
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/10/1093/plphys/kiad155
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