研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法有很多，不知道大家平时都用哪些方法？
小编今天介绍的是用的不多的双分子荧光互补（ bimolecular fluorescence complementation/ BiFC）实验，但是大家都挺感兴趣的的。双分子荧光互补（BiFC）是一种可视化活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用和定位的技术，已经被广泛应用于各种模式生物中。网上有很多帖子也讲了这个实验，但是大部分都是到处抄来拼接到一起，骗粉丝流量的。这种基本上一看就会，一做就废。原理：BiFC检测的原理就是把增强型***荧光蛋白（EYFP）从特定的位点分割成N端部分（N-fragment）和C端部分（C-fragment），然后把N端部分和C端部分，分别放到两个不同的载体上，于是就有了两个空载体：pBiFC-VC155和pBiFC-VN155（I152L)。下图分别是pBiFC-VC155的图谱和***区、pBiFC-VN155（I152L)的图谱和***区。EYFP被分成了两段，所以不能发光。但是如果空间上靠的很近的话，就可以恢复发光。因此要研究蛋白A和蛋白B有没有互作，就分别把A和B***到pBiFC-VC155和pBiFC-VN155（I152L)上，然后共转染到细胞里，如果A和B互作，就会发光。还有个好处就是能看到相互作用的定位情况。BiFC原理（Océane Marescal/ 2020/ Bio Protoc）
要注意的是，细胞里大量表达的EYFP两个片段可能自发的结合在一起，从而产生假阳性的背景荧光，所以对照组要做pBiFC-VC155和pBiFC-VN155（I152L)空载体的共转染。另外，这个是EYFP，不是所有荧光显微镜都可以直接看YFP的，做之前一定要确认有可以看YFP的显微镜。网上很多帖子都不说这一点，害人不浅。网上很多不专业的博主抄来的帖子，不会看图谱，所以不知道pBiFC-VC155载体上带的是HA标签，pBiFC-VN155（I152L）载体上带的是Myc标签。也就是说，如果在荧光显微镜下观察到荧光，初步判断两个蛋白有相互作用的话，还可以收样做Co-IP验证，简直一举两得，直接一波拿下两张Figure，组会PPT就搞定了。
pBiFC-VC155和pBiFC-VN155（I152L)这两个空载的多***区都是在Tag和EYFP片段之间。如果有的家人们研究的蛋白的C末端很特殊，需要暴露出C末端的话，可以用同源重组法***到VC155后面（终止密码子之前），最好要记得加上GSGG linker。Tag前面有自己的起始密码子，从Tag到VC155结束，整个阅读框都没有移码，所以可以直接***到终止密码子之前。
为了避免家人们一看就会，一做就废，案例分析肯定少不了。
这是一篇2013年发表在《PLOSGENETICS》上的文章，图1就是用BiFC证明了ATG8a和NBR1在植物中的相互作用。把ATG8a和N-YFP融合，把NBR1和C-YFP融合，就能产生***荧光证明ATG8a和NBR1互作。这里用了三个对照，一是ATG8a-N-YFP和C-YFP空载不能产生荧光；二是N-YFP空载和NBR1-C-YFP不能产生荧光；三是ATG8a-N-YFP和mNBR1-C-YFP不能产生荧光（之前有人报道过NBR1W661A/I664A突变不能和ATG8a互作）。所以，BiFC这个实验就是只要会分子***、细胞转染和荧光显微镜使用的，都能做出来。
ATG8a和NBR1在植物中的相互作用（Jie Zhou et al/ 2013/ PLoS Genet）
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很多朋友问题都一样，私信一个个回复效率太低了。实验中有问题的家人可以到小程序的交流区评论留言，既可以提问，也可以回答别人的问题。
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