质粒单酶切线性化
配制总体积为 100µl 的***性内切酶（100U）酶切体系线性化 10ug 质粒（具体用什么酶根据载体而定，选择polyA后的单酶切位点）。37℃条件下，孵育 2h。
2/苯酚***仿沉淀法纯化线性化的质粒DNA
孵育完成后，体系中加入 100µl 苯酚：***仿抽提，涡旋振荡后， 13000rpm 离心 1min，取上清置于新的无核酸酶离心管中。向原体系再加入 100µl 无核酸酶水，涡旋振荡后， 13000rpm 离心 1min，去上清置于同一离心管。再向该 EP 管中加入 200µl ***仿，涡旋振荡后， 13000rpm 离心5min。取上清约 200µl 于新的无核算酶离心管中。随后加入 1/10 体积的 3MpH5/2 NaAc（20µl）， 3 倍体积的预冷的 100%乙醇（600µl），轻轻混匀。-20℃冰箱内沉淀 20 分钟或过夜沉淀。之后， 4℃条件下 13000g 离心 15min，小心移走上清，再加入 1ml 75%乙醇轻轻洗涤沉淀。再次在 4℃条件下 13000g 离心 15min，移去所有上清液。打开管盖，静置大约 5-10 分钟挥发残余乙醇。最后加入 15µl 无核酸酶水溶解沉淀（有时候能看见少量的白色的DNA沉淀，有时候看不到，取决于操作水平），并用 Nanodrop 测定 DNA 浓度。
3/线性化的质粒DNA体外转录成RNA
图1：体外转录体系
体外转录用的RNA聚合酶一般为sp6或T7，根据质粒上的启动子是SP6还是T7选择对应的体外转录试剂盒。
配制体系所需***头，离心管均为无核酸酶级别。恒温 37℃反应 2h 后，体系中加入 DNAase 酶 1µl， 37℃， 30min，消化反应模板中的线性DNA。
方法一（***化锂沉淀法）：消化完成后，再加入 30µl***化锂， 30µl 无核酸酶水，轻轻混匀， 终止反应，随后在-20℃冰箱静置 30 分钟或过夜静置。之后，样品于 4℃， 13000g 离心 15 分钟。小心移去管内液体后，加入 1ml 75%乙醇小心洗涤沉淀物。随后， 4℃条件下 13000g 离心 15 分钟。最后小心移去所有残余液体，打开管盖静置 5-10 分钟挥发残余乙醇。最后加入 100µl 无核酸酶水于溶解沉淀。Nanodrop 测定 RNA 浓度，分装 RNA，每管10µg。置于-80℃冰箱保存。体外转录得到的 RNA经电泳鉴定条带完整度和大小是否符合预期。
方法二（苯酚***仿沉淀法）：同步骤2。消化完成后，体系中加入 100µl 苯酚：***仿抽提，涡旋振荡后， 13000rpm 离心 1min，取上清置于新的无核酸酶离心管中。向原体系再加入 100µl 无核酸酶水，涡旋振荡后， 13000rpm 离心 1min，去上清置于同一离心管。再向该 EP 管中加入 200µl ***仿，涡旋振荡后， 13000rpm 离心5min。取上清约 200µl 于新的无核算酶离心管中。随后加入 1/10 体积的 3MpH5/2 NaAc（20µl）， 3 倍体积的预冷的 100%乙醇（600µl），轻轻混匀。-20℃冰箱内沉淀 20 分钟或过夜沉淀。之后， 4℃条件下 13000g 离心 15min，小心移走上清，再加入 1ml 75%乙醇轻轻洗涤沉淀。再次在 4℃条件下 13000g 离心 15min，移去所有上清液。打开管盖，静置大约 5-10 分钟挥发残余乙醇。最后加入 100µl 无核酸酶水溶解沉淀（正常的话能肉眼看到大量白色的RNA沉淀）。Nanodrop 测定 RNA 浓度，分装 RNA，每管10µg。置于-80℃冰箱保存。体外转录得到的 RNA经电泳鉴定条带完整度和大小是否符合预期。
4/ RNA可用电转法或lipo转染试剂转染细胞验证蛋白表达
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