小编梳理了一下质粒构建和表达中容易出现的各种问题和解决办法，你中了几条？即便是分子***大神，有时候难免也会出现其中的一些错误。很多坑，小编和身边的朋友都踩过，简直苦不堪言。
问题1/质粒老是连不上或空载率很高。
原因及解决办法：
A/ 如果是用双酶切法构建的话，可能酶切时间太短，载体没充分切开。
B/ T4 DNA连接酶或重组酶的问题。每个实验室都有几个小可爱，用完酶不及时放回冰箱在外面放了一晚上，然后第二天发现后就偷偷放回冰箱不提醒别人。这时候酶可能已经失活了。
C/ 酶过期了。实验室初期很有钱买了一堆酶用不完，后期实验室没钱了，酶过期了又不舍得扔，侥幸心理继续用。每个实验室都有大聪明看都不看日期直接拿来就用。
D/ 如果用同源重组法构建的话，PCR扩增载体的时候模板质粒DNA加多了，Dpn1没充分消化掉原始模板。
E/ 目的基因太短了，PCR出来跑胶回收的时候没有加异丙醇，导致没有回收到。做常规长度的DNA回收习惯了，突然来个短的没反应过来。
问题2/ 从细胞总RNA中PCR扩增目的基因，总是扩增不出来。
原因及解决办法：
A/ 如果操作都没问题的话，那么最可能的原因就是选择的细胞类型不合适，可能这个细胞不表达目的基因或者表达量很低。
这时候需要去检查一下你的目的基因在哪些细胞中表达，挑选表达量较高的细胞，重新提取RNA-反转录然后PCR扩增。如果目的基因在天然状态下表达量很低，但可以在某些信号***下诱导表达，可以先用***物处理细胞，诱导目的基因大量表达，再提取RNA-反转录然后PCR扩增。例如，我们在扩增干扰素***基因时，一般先用Poly(I/C)***过夜，然后再提取RNA-反转录然后PCR扩增，一般这时候就很容易扩增出来了。
还有一种情况是，表达量较低但不是低到离谱，可以优化下RNA提取步骤，提高RNA的质量或浓度，PCR扩增的时候增加模板量，PCR一轮回收之后，再以第一轮PCR产物作为模板进行第二轮PCR。
B/ 目的基因太长了。
这时候可以把目的基因分成两段进行PCR，然后overlap将两个片段连接起来。
C/ 引物不合适。有时候扩增的目的基因刚好在N端或C端的G/C含量很异常，导致没有合适的引物。
这时候可以先跳过G/C含量异常的区域，从其他位置设计引物先将目的基因扩增出来纯化回收后。设计新的引物将G/C含量异常的片段区域放到引物末端突出位置，以第一轮PCR的产物为模板进行第二轮PCR，通过引物将G/C含量异常的片段引物到目的基因上去。
D/ 设计的引物不特异，也就是说引物可以识别好几种基因，因为很多基因可能有同源性很高的片段。
一个方法是在跑胶后回收目的基因大小的片段。二是在平板上多挑几个***测序，其中可能有需要的基因（当然也会混杂其他不需要的基因）
E/ PCR扩增的片段比我需要的基因短。
如果引物特异的话，PCR条带也很特异，很亮的话，可能是扩增出来了不同的转录本（isoform），有些isoform在可变剪接后会比全长的要短一些。不同的isoform在不同细胞系里的表达丰度也是不一样的。如果测序发现短的不是很多的话，可以将缺失的片段设计到引物上，通过PCR载体全长来将缺失的片段***进去。如果重复好几次都是缺失的比较长，可以换不同的细胞系提RNA反转录后再PCR。
F/ 目的基因太长了。一般大于3000 bp的基因，从细胞里扩增的话就比较难了。短于1500 bp的通常都很好扩增。实在困难的就建议基因合成了。
G/ 偶发事件，做实验开小差了或者和旁边人说话，漏加成分了。
问题3：构建的质粒测序连上了，但是不表达
原因及解决办法：
A/ 目的基因前面没有起始密码子。这种情况容易出现在将目的基因从A载体上转移到B载体上的时候。例如A载体的标签在N端，所以标签前面自带起始密码子，但是B载体的标签在C端，这时候从A载体上PCR扩增目的基因时候容易忽略起始密码子。
以目的基因***pEGFP-N1载体为例，目的基因需要自己有起始密码子，并且要删掉目的基因自己的终止密码子。
图1：pEGFP-N1质粒图谱
B/ 目的基因不含有终止密码子。类似于A情况。例如B载体的标签在C端，所以标签后面自带终止密码子，但是当我们将目的基因从B载体上PCR扩增的时候容易忽略掉终止密码子，直接***A载体（标签在N端）。
C/ 目的基因和标签之间含有终止密码子。也是类似于A和B的情况。这种情况容易出现在当我们将目的基因从A载体（标签在N端，所以目的基因后面有自己的终止密码子）转移到B载体（标签在C端）的时候，整段将目的基因带着终止密码子***B载体，这样目的基因和标签之间就有终止密码子了。用标签抗体验证的时候就检测不出来蛋白表达了。
以目的基因***pEGFP-N1载体为例，要删掉目的基因自己的终止密码子，不然翻译到目的基因就结束了，检测不到GFP表达。
D/ 三联密码子移码了。这种情况特别容易出现在用双酶切法构建质粒的时候。大多数空载体上的多***区双酶切后都会导致移码，如果粗心大意不补齐的话，很容易出现这种现象，可能做了几个月都找不到原因。
以目的基因***pEGFP-N1载体为例，如果用双酶切法，选择的第二个酶是BamH1时，目的基因和EGFP之间是ggatccaccggtcgccacc，19bp就移码了，所以检测不到GFP表达。
问题4：我是分子***大神，没有以上问题，但还是不表达或表达量极低
原因及解决办法：
A/ 目的蛋白的N端存在“N端规则，N-end-role”，这个N端规则可能是（1）目的蛋白本身就存在的，也可能是（2）目的基因***载体上的时候引入的。
N端规则是蛋白质N端残基组成的称为N-degrons的信号导致的蛋白质迅速降解。在真核生物中，N端规则途径是泛素系统的一部分，由两个分支组成，即Ac/N端规则和Arg/N端规则途径。
Ac/N端规则途径靶向含有N（α）末端乙酰化（Nt-乙酰化）残基的蛋白质。例如，超过80%的人类蛋白质是共翻译的Nt-乙酰化修饰的。因此，大多数蛋白质从合成的那一刻起就具有特定的降解信号，称为（Ac）N-degron。
Arg/N端规则途径可识别未乙酰化的N端残基，并涉及N端精氨酸化，以及E3 N-识别物靶向特定的未修饰N-末端残基。在真核生物中，N-识别是由与特定N-degron结合的E3泛素连接酶决定的。E3 N-识别物及其同源E2 泛素结合酶的复合物在其内部Lys残基处控制N端底物，从而靶向这些蛋白质被26S蛋白酶体降解。
这两种N端规则共同靶向降解大多数细胞蛋白，甚至能够导致蛋白质在数秒内即被降解。特定的N端规则途径也存在于原核生物和线粒体中。产生N-degrons的酶包括蛋氨酸氨基肽酶，半胱天冬酶，钙蛋白酶，Nt-乙酰酶，Nt-酰胺酶，精氨酸转移酶和亮酰基转移酶。目前已知甘氨（glycine）、赖氨酸（lysine）、精氨酸（arginine）和半胱氨酸（cysteine）对蛋白不稳定性的促进作用最强。
Cullin蛋白家族中的ZYG11B和ZER1也能介导***于UBR蛋白的甘氨酸作为N端降解子的蛋白降解途径。在细胞内重要的翻译后修饰——豆蔻酰化（myristoylation）失效时，原本被保护的蛋白N端甘氨酸残基暴露在外，使蛋白受到ZYG11B和ZER1泛素酶的攻击而稳定性大大降低。或者作为强效N端降解子的甘氨酸残基在凋亡过程中由半胱天冬酶（caspase）介导产生的反应物中显著富集，因此甘氨酸降解子特异泛素酶能够高效率地降解凋亡产物。
图2：The mammalian Arg/N-end rule pathway（Alexander Varshavsky/ 2011/ Protein Science）
图3：甘氨酸N端降解规则（RICHARD T/ TIMMS et al/ 2019/ Science）
B/ 目的蛋白分子量太小导致的不稳定。
最简单的解决办法就是把这个目的基因***到EGFP载体上，增大融合蛋白的分子量就行了。小编亲身经历，曾经构建非洲猪瘟病***的I9R（11/3 kDa）和X69R（8/3 kDa）这两个基因的时候，加HA标签不表达。然后加EGFP标签增加蛋白质分子量就可以正常表达了。
C/ 密码子使用频率低，即目的基因中的密码子不是表达细胞偏好的密码子。尤其是在真核细胞中表达病***蛋白或原核生物来源的蛋白的时候，可能需要优化密码子。
解决办法就是对目的基因进行优化，改成表达细胞高频使用的密码子。一般要交给公司基因合成，均价在0/6-0/8元/bp。
图4：猪密码子使用频率表
图5：人密码子使用频率表
图6：恒河猴密码子使用频率表
更多物种的密码子使用频率可以在密码子使用数据库（/codon/）里查询，输入物种名的拉丁名，点submit就可以了。
图7：密码子使用数据库界面
问题5：我中邪了，表达量莫名的低找不到原因。
解决办法：
1/ 查查文献里研究这个基因的人，是把基因构建在哪个载体上的。直接照抄别人的条件就行了。
2/ 在目的基因前面***翻译增强肽和2A肽，促进蛋白质表达。
如果大家质粒构建还有什么问题，可以给作者私信或留言。小编水平有限，如有遗漏或错误，请见谅。
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