1/ 包被过程(注意设置空白对照/***性对照)/
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度/每孔抗原加入100μl/置37℃/4h/或4℃/24h/弃去孔中液体/(为避免蒸发/板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2PBS洗3次/每次3分钟。
具体为/吸干或甩干孔内反应液//用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后/即甩去)/浸泡/即将洗涤液注满板孔/放置1-2分钟/间歇摇动/浸泡时间不可随意缩短/吸干孔内液体/可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干//重复操作涤3次。
3/ 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度)/
检测时一般采用1/50-1/400的稀释度/应采用较大稀释体积进行/一般保证样品吸取量>/20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中/每样品至少加双孔/每孔100μl/置于37℃/40-60min。
4PBS洗3次/每次3分钟。
5/ 加入酶标抗体/
酶标抗体/根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度/37℃/30-60min 之间/短于30min往往结果不稳定/每孔加100μl。
6PBS洗3次/每次3分钟。
7/ 加入底物(现用现配)/
TMB(四甲基联苯胺)使用液/TMB(10mg/5ml***)0/5ml底物缓冲液(PH5/5) 10ml0/75%H2O232μl/底物加入量每孔100μl(TMB空白显色孔除外)/置37℃避光放置20-25分钟。
8/ 终止反应/
每孔加入终止液50μl(2MH2SO4)终止反应/此时蓝色立转***/于20min内测定实验结果。
9 结果判断/
可于白色背景上/直接用肉眼观察结果/反应孔内颜色越深/阳性程度越强/***性反应为无色或极浅。也可测吸光值/在ELISA检测仪上/TMB反应产物检测需要450nm波长/检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组***性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示/当P/N大于2时作为抗体的效价即大于***性对照吸光值的2倍/(数值的大小依具体检测要求而定)。
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