精读1篇文献胜过泛读1万篇文献。
现在就和小编一起庖丁解牛式地阅读文献，先由简入繁，由浅入深，来看一篇简单的。文章有点长，建议准备好零食和奶茶静下心来仔细阅读。一次性看不完的话，建议收藏反复观看，每次看都会有不一样的体会。
这是一篇2021年发表在《mBio》上的文章“SARS-CoV-2 Nsp5 Demonstrates Two Distinct Mechanisms Targeting RIG-I and MAVS To Evade the Innate Immune Response”。SARS-Cov-2的Nsp5蛋白通过两种不同的机制拮抗RIG-I和MDA5从而逃逸天然免疫应答。
图1***：
首先，作者用SARS-Cov-2或/和Sendai virus (SeV，仙台病***，研究干扰素通路常用的模式病***)感染Calu-3人肺癌细胞，用q-PCR荧光定量的方法检测了IFNb、ISG56、ISG15、CXCL-10和IL-6的mRNA水平，发现仙台病***激活这些基因的转录，而SARS-Cov-2能够抑制这些基因的转录（图1A）。下面就不出意外的筛是哪个基因抑制干扰素信号通路了。这里用的双荧光报告的方法（小编之后会出一期讲一下这个实验），就是用不同的SARS-Cov-2质粒和IFNβ-Fluc报告质粒、pRL-TK内参质粒共转染，然后用MAVS质粒***IFNβ启动子表达，于是得到结果NSP1、NSP5和ORF6抑制MAVS诱导的IFNβ激活了。双荧光报告实验中，想筛哪个通路，就用对应通路的质粒或者药物***就行了。对于NSP1，作者解释说：Nsp1对IFN诱导的抑制主要是由于Nsp1对IFN的高基础诱导引起的负反馈抑制。ORF6已经有人报道了通过抑制IRF3的核转位抑制IFN的产生。这里还测试了NSP5-C145A酶活性丧失的突变，发现其不能抑制MAVS诱导的IFNβ激活，说明NSP5的抑制作用和酶活性有关（图1B）。图1C则是用双荧光报告实验验证了NSP5的酶活性呈剂量梯度地对IFN的抑制作用。图1D又是用q-PCR方法说明NSP5的酶活性对抑制IFNb、ISG56、ISG15、IL-8和IL8等抗病***基因的表达是关键的。当然只用q-PCR检测mRNA水平是不够的，于是做了图1E的ELISA检测IFNb、IL-6和IL-8的表达。然后作者就把干扰素通路的RIG-1、MDA5、MAVS、TBK1、TRAF6、IKKβ、IKKγ、IKKε从上到下撸了一遍，自然而然地就发现NSP5能够下调RIG-1和MAVS的表达（图1F和1G，其余没影响的放在补充材料里的）。顺水推舟，Co-IP验证了NSP5和RIG-1以及MAVS互作（图1H和1I）。
图1：SARS-CoV-2 Nsp5靶向RIG-I和MAVS从而抑制IFN的产生
图2***：
图1发现NSP5能够下调RIG-1和MAVS的表达。所谓的下调表达可能发生在mRNA水平，常见的有1）降解mRNA；2）抑制mRNA出核转运等。发生在蛋白水平的下调常见的有：1）降解蛋白质；2）切割蛋白质。大家看到下调，通常会习惯性地认为是降解了，当然也可能是切割产生小条带了，WB曝光小区域的膜看不到而已（即便确定发生在蛋白水平，也要补充一张图用q-PCR检测排除mRNA表达水平的影响）。所以看到下调现象的时候，小编建议大家再曝一张全膜看看，排除切割现象。这里由于NSP5是蛋白酶，而且上面也证明蛋白酶活性对NSP5抑制IFN是必需的，所以很明显NSP5大概率是切割了某些东西。
这里作者先用SARS-Cov-2感染了稳定表达Flag-RIG-I的Caco2细胞系，发现病***感染能够下调RIG-I（图2A）。共转染Flag-RIG-1和Strep-NSP5，发现NSP5下调了Flag-RIG-1，但对内源性的RIG-I没有影响（图2B），说明NSP5可能切割了RIG-1的N端，产生的小条带没法和全长的区分开。但是Flag-RIG-I因为加了Flag标签，分子量变大了，所以能区分开。然后作者就用Flag-RIG-I-N或Flag-RIG-I-ΔN（缺失2个CARD区）和NSP5-Strep共转，发现NSP5只能切割含有N端的RIG-I，也就是说NSP5切割RIG-I的位点在N端（图2C和2D）。接下来作者纯化了GST-RIG-I-N、NSP5和NSP5-C145A，做了各体外切割实验证明NSP5通过蛋白酶活性切割RIG-I的N端（图2E）。通过比较人、猴、犬、蝙蝠、鼠和猫的RIG-I序列（图2F），发现NSP5可能切割LQA位置，这和之前文章报道的L和A位于Q两侧时有利于NSP5的切割。为了验证NSP5是在Q10残基处切割RIG-I，作者构建了RIG-I-Q10E突变。并且纯化了GST-RIG-I-Q10E蛋白，体外切割实验表明NSP5不能切割GST-RIG-I-Q10E突变（图2G），说明NSP5切割RIG-I的Q10残基。最后，作者分离了RIG-I缺失的MEF细胞，回补RIG-I-WT或RIG-I-Q10E（图2H）。用仙台病***感染表达RIG-I-WT的细胞能够激活IFNb、ISG15和ISG56的转录，NSP5则能抑制仙台病***激活这些基因的转录。但在表达RIG-I-Q10E突变的MEF细胞中，NSP5则不能抑制仙台病***诱导的基因转录（图2I）。图2I本质上就是图1A和图1D再来一遍。
图2：NSP5在Q10残基处切割RIG-1
图3***：
因为之前有报道说RIG-I的N端前10个氨基酸的缺失阻碍了其和游离的泛素链结合，从而激活IRF3。所以作者也构建了前10个氨基酸缺失的突变命名为RIG-I-（11-925）。通过慢病***感染的方式把RIG-I-WT或RIG-I-（11-925）整合到RIG-I缺失的MEF细胞中（图3A）。图3B和图3D一样的意思，说明RIG-I的N端前10个氨基酸对基因转录很重要，因为仙台病***感染表达RIG-I-（11-925）的细胞，激活的基因转录显著降低了。图3C就发现表达RIG-I-（11-925）的细胞中RIG-I下游的TBK1的***酸化水平降低了。然后又又又是IFNβ和NF-κB的双荧光报告实验，结合剂量梯度转染，说明RIG-I的N端前10个氨基酸对IFNβ和NF-κB的激活很重要（图3E）。图3F和图3C差不多，仙台病***感染表达RIG-I-（11-925）的细胞时，RIG-I下游的TBK1***酸化和IRF3的***酸化水平都下调了。大家都知道RIG-I是一种识别dsRNA的模式识别分子，并且RIG-I的C端对其结合dsRNA是必需的。因此作者做了个凝胶迁移实验，排除了RIG-I的N端前10个氨基酸的缺失对识别dsRNA的影响（图3G）。既然N端对RIG-I识别dsRNA没有影响，那么很可能是影响了RIG-I向MAVS的信号转导了。于是作用通过Co-IP实验发现仙台病***感染能够触发RIG-I结合MAVS，而RIG-I-（11-925）则不能结合MAVS（图3H）。
图3：RIG-I的N端前10个氨基酸对其信号转导是必需的
图4***：
图1中作者发现NSP5能够下调RIG-1和MAVS。图2和图3阐明了NSP5通过蛋白酶活性切割RIG-I的N端第10位D残基。所以图3就开始研究NSP5是怎么下调MAVS了。首先还是和我们***图2的开始所说的，下调是发生在mRNA水平还是蛋白水平。所以图4A中作者用SARS-Cov-2感染，发现MAVS的下调也是发生在蛋白水平，实际上感染后MAVS的mRNA水平是上调的。然后作者也对MAVS的可能切割位点做了突变，发现NSP5不切割MAVS，因此这部分数据没有展示出来。所以作者猜测NSP5下调MAVS可能不依赖于蛋白酶活性，这一点和下调RIG-I是不同的。为了验证这一猜想，作者用CHX放线菌酮去抑制蛋白合成，测了一下MAVS在NSP5存在下的半衰期，发现NSP5缩短了MAVS的半衰期（图4B）。在做点突变对蛋白功能影响的时候，一般都会比较下突变和WT的表达量变化或者测一下蛋白质稳定性，因为功能的改变也可能是表达量变化导致的。由于哺***动物细胞中存在蛋白酶体和溶酶体这两提种主要的降解途径，因此作者分别用MG132和NH4CL去抑制蛋白酶体和溶酶体，发现MG132能逆转NSP5对MAVS的降解，说明NSP5诱导MAVS通过蛋白酶体途径降解（图4C）。有些很严谨的文章会多用几种蛋白酶体和溶酶体的***，因为有时候一种***可能效果不明显，从而导致误判。故事走到蛋白酶体途径，接下来就是泛素化的老掉牙套路了。先用免疫沉淀证明NSP5促进MAVS的泛素化（图4D）。由于K48泛素化和K63泛素化是玩的最多的，所以作者测了K48R（泛素的第48位赖氨酸突变为精氨酸）和K63R（泛素的第63位赖氨酸突变为精氨酸），于是发现K48R减少了MAVS的泛素化，说明NSP5诱导MAVS发生K48泛素化修饰（图4E）。证明泛素化之后，就是找关键角色E3泛素连接酶了。作者这里做了个体外泛素化实验，添加E1、E2（UbcH5b）NSP5、MAVS、Ub，发现NSP5可以作为E3泛素连接酶（图4F），催化MAVS的泛素化。
其实泛素化的类型有很多，包括：M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63和G76。如果要严谨地说明是K48类型泛素化的话，还需要补充一个MAVS和Ub-K48 only（只保留泛素分子上第48位一个赖氨酸泛素化位点，其他泛素化位点全部突变）的Co-IP实验。小编后面会出几期文章好好***一下泛素化。
图4：NSP5促进MAVS的泛素化降解
图5***：
泛素化套路三要素：1）泛素化类型；2）泛素化位点；3）E3连接酶。图4找到了MAVS的泛素化类型是K48，E3酶是NSP5，那么接下来就是找泛素化位点了。由于MAVS的内部翻译起始位点的存在，导致其能够表达出来70kDa、50kDa和30kDa不同长度的isoforms，分别命名为MAVS70、MAVS50和MAVS30。不同长度的MAVS和NSP5共转染发现NSP5只能降解MAVS70，而不能降解MAVS50（图5A）。因此很巧妙地锁定MAVS的泛素化位点应该在N端的前140个氨基酸之内，在此之内只有K7、K10和K136这3个赖氨酸位点。如果没有这种天然存在的isoforms，可以用不同截断体的方法锁定泛素化的区域。然后作者构建了2种突变：MAVS-K7/10R（K7/K10两个位点都突变为R）和MAVS-K136R，于是发现NSP5不能降解MAVS-K136R，仍然能够降解MAVS-K7/10R，说明NSP5介导MAVS的K136位点泛素化（图5B）。图5C就和图4B一样的路子，NSP5缩短了MAVS-WT的半衰期，但是不能缩短MAVS-K136R的半衰期，更说明K136位点是NSP5介导MAVS降解的关键位点。图5D还是通过Co-IP方法确认了MAVS-K136R突变不能被NSP5泛素化。之后，作者又用慢病***递送的方式，在MAVS缺失的MEF细胞中稳定表达MAVS-V5-WT或MAVS-V5-K136R（图5E）。在表达MAVS-V5-WT的细胞中，NSP5能抑制抗病***基因的转录，但是在表达MAVS-V5-K136R的细胞中，NSP5则不能抑制抗病***基因的转录（图5F）。
图5：NSP5靶向MAVS的K136残基促进其泛素化降解
图6***：
前面已经阐明了NSP5切割RIG-I的第10位Q残基，同时NSP5作为E3酶也能催化MAVS的K136位点发生K48类型泛素化降解。所以后面要回归病***感染本身的情况下，不能只停留在蛋白表达层面上的研究。
于是作者在Caco2细胞中表达了Flag-RIG-1-WT或Flag-RIG-I-Q10E（图6A）以及MAVS-V5-WT或MAVS-V5-K136R（图6C）。用SARS-Cov-2感染发现，Flag-RIG-I-Q10E和Flag-RIG-1-WT相比，MAVS-V5-K136R和MAVS-V5-WT相比，抗病***基因的转录水平更高（图6B和图6D）。因为NSP5能同时拮抗RIG-I和MAVS，于是作者在Caco2细胞中同时表达Flag-RIG-1-WT+MAVS-V5-WT或Flag-RIG-I-Q10E+MAVS-V5-K136R（图6E），用SARS-Cov-2感染发现，和Flag-RIG-1-WT+MAVS-V5-WT相比，Flag-RIG-I-Q10E+MAVS-V5-K136R组抗病***基因的转录水平更高（图6F）。为什么要做这个RIG-I和MAVS共表达时候的实验，因为NSP5是同时拮抗RIG-I和MAVS的。如果大家仔细看的话，无论是同时表达Flag-RIG-1-WT+MAVS-V5-WT，还是同时表达Flag-RIG-I-Q10E+MAVS-V5-K136R，感染情况下基因转录水平都比单独表达时要高。图7G、7H和7I分别用WB、q-PCR和plaque assay这三个实验，在病***蛋白表达、病***基因mRNA表达和滴度3个层面说明RIG-I-Q10E和/或MAVS-K136R能够抑制SARS-Cov-2的复制。
图6：RIG-I-Q10E和MAVS-K136A在SARS-CoV-2感染期间拮抗NSP5的抑制作用，从而恢复天然免疫的激活
图7***：
由于NSP5不仅能够拮抗天然免疫，作为半胱氨酸蛋白酶还能加工非结构蛋白，因此可能作为抗病***药物设计的靶点。于是作者合成了图7A中的2种靶向NSP5蛋白酶催化中心的药物，分别叫2CN113和2CN115。通过点击化学方法（去年获诺奖的方法）和荧光凝胶分析，表明2CN115能够共价结合NSP5（图7B）。2CN113共价结合NSP5，因此很自然的在体外切割实验中，2CN113能以剂量依赖方式抑制NSP5切割RIG-I（图7C）。前面说了NSP5能够切割病***自身的多聚非结构蛋白，因此作者证明了2CN113也能在病***感染情况下抑制NSP5切割NSP7-NSP8多聚蛋白（图7D）。作为全文占比很大的抗病***基因的转录水平指标，2CN113也是以剂量梯度依赖方式促进了SARS-Cov-2感染时的抗病***基因转录（图7E）。因而一个合理的假设就是2CN113能够抑制SARS-Cov-2的复制。最后就是用q-PCR方法和plaque方法证明了在Caco2细胞和Vero-ACE2细胞中，2CN113都能够抑制SARS-Cov-2的复制（图7F、7G、7I和7J）。作者也用plaque assay和细胞增殖试剂分别测了2CN113抗SARS-Cov-2的半数抑制量和细胞***性（图7H和7K），做抗病***测试的时候，这两个实验基本上都是必做的，没啥好说的。
图7：Nsp5 的小分子***可恢复天然免疫的激活并且抑制 SARS-CoV-2 的复制
这篇文章主要用到了以下实验方法和技能，大家可以对照一下自身的掌握情况：
细胞培养、转染、RT-q-PCR、western blot（WB）、Co-IP（免疫共沉淀）、ELISA、双荧光报告、分子***和点突变质粒构建、慢病***的包装感染和稳转细胞系构建、原核表达和蛋白纯化、体外泛素化实验、RNA的EMSA实验、凝胶荧光成像、病***感染（SARS-Cov-2需要在BSL-3进行，仙台病***需要在BSL-2进行）、蚀斑法（plaque assay）、蚀斑减少实验、细胞***性测试、小分子药物合成等。
以上实验方法基本上在大多数文章里都会用到，小编建议大家针对性的学习实验方法和技能。掌握了方法，培养好思维，大家都能造出这样的文章。
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